由于受到光學(xué)衍射極限的限制，普通光學(xué)顯微鏡分辨率只能達到200nm，而通常病毒和亞細胞結(jié)構(gòu)的尺寸只有幾十到200多納米，遠遠小于普通光鏡的分辨率。超高分辨顯微技術(shù)的出現(xiàn)，為觀測這類精細結(jié)構(gòu)提供了可能，因此也得到了越來越廣泛的應(yīng)用。作為超高分辨技術(shù)的，受激發(fā)射損耗（STimulated Emission Depletion, STED）技術(shù)更是在生命科學(xué)領(lǐng)域尤其是病毒學(xué)相關(guān)研究中發(fā)揮著重要作用。
 
本次為大家分享STED技術(shù)在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用和新進展，助力生命科學(xué)研究和發(fā)展。
 

STED基本原理

2014年諾貝爾化學(xué)獎授予三位科學(xué)家，以表彰他們發(fā)明超高分辨顯微技術(shù)。其中Stefan Hell發(fā)明了STED技術(shù)，而徠卡公司也是*將其商業(yè)化。從2007年開始，徠卡STED產(chǎn)品不斷創(chuàng)新和優(yōu)化，已經(jīng)擁有近13年的STED技術(shù)積累。2014年*推出SP8 STED 3X，即榮獲當(dāng)年的R&D100大獎。2019年更是創(chuàng)新性的推出了τ-STED，進一步在提升分辨率的同時降低了激光功率，更適合活細胞超高分辨成像。

                                             2014年諾貝爾化學(xué)獎獲得者，左起分別是：Eric Betzig、Stefan W. Hell、William E. Moerner

說了這么多，STED技術(shù)原理到底是什么呢？很簡單。我們想象一下，一個點發(fā)射出的熒光信號，被檢測后通常是一個衍射斑；如果我們同時使用一個甜甜圈樣的激光將其周圍的信號擦除掉，只允許中心很小的熒光信號發(fā)射出來，這樣分辨率不就提高了嗎。這個起擦除作用的激光便是STED激光，也叫損耗光，利用的是熒光的受激發(fā)射損耗原理。之后，通過對圖像的掃描，即可直接呈現(xiàn)超高分辨圖像，無需任何后續(xù)計算過程。同時，根據(jù)公式，可通過增加STED激光功率來提升圖像分辨率。

STED原理示意圖：STED通過受激發(fā)射損耗去除衍射環(huán)上的熒光信號，大大縮小有效的激發(fā)區(qū)域，從而改寫了分辨率公式，提高了光學(xué)分辨率

STED技術(shù)在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用實例

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*應(yīng)用實例，是對病毒精細結(jié)構(gòu)的觀察。2012年發(fā)表在期刊science上，標(biāo)題為：熒光納米顯微鏡（STED）揭示成熟依賴的HIV-1病毒表面蛋白的再分布特征【1】。

圖中綠色代表HIV-1病毒粒子，紅色表示病毒表面的膜蛋白。可以看到，通過普通共聚焦無法分辨膜蛋白的具體定位位置，很模糊。包膜糖蛋白gp120（紅色）與病毒粒子（綠色）90%共定位，信號模糊，分辨不出細節(jié)。而STED成像可以發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)成熟病毒粒子表現(xiàn)出單一的包膜蛋白Env或焦點(圖1B)，而大多數(shù)未成熟粒子表現(xiàn)出兩個或兩個以上的包膜蛋白Env(圖1D)。

02

第二個應(yīng)用實例，是對病毒成熟過程的觀察。標(biāo)題為：STED納米顯微鏡揭示HIV病毒蛋白水解成熟的時間過程【2】。

利用STED顯微鏡發(fā)現(xiàn)在HIV-1病毒成熟和未成熟條件下，可非常清晰區(qū)分其Gag蛋白的不同結(jié)構(gòu)特征。未成熟病毒的Gag蛋白呈中空環(huán)狀（圖a），而成熟病毒中呈實心固縮狀（圖b）。

作者巧妙的利用光控方法，進行STED時間序列成像。在400nm紫外光照后，PDI（光催化降解的蛋白酶抑制劑）降解，Gag蛋白能夠被蛋白酶水解切割，進而病毒成熟。STED時間序列成像可輕松捕獲病毒從未成熟到成熟過程，Gag蛋白重排的結(jié)構(gòu)變化過程。

03

第三個應(yīng)用實例，是對病毒基因組示蹤。標(biāo)題為：以單分子分辨率示蹤宿主細胞中的病毒基因組【3】。

腺病毒DNA通過AF594標(biāo)記的疊氮點擊反應(yīng)顯示，衣殼蛋白通過抗hexon的抗體識別，并且只有在脫殼后，病毒DNA才可以被反應(yīng)檢測到熒光信號。
 
通過gated STED超高分辨顯微成像，可顯著提高分辨率，清晰呈現(xiàn)病毒衣殼和DNA的真實尺寸大小。腺病毒衣殼實際大小約80nm，gSTED顯示約110nm（包含一二抗尺寸），與實際一致。gSTED顯示被衣殼蛋白包裹的病毒DNA尺寸略小于80nm，也與衣殼尺寸符合。

 
04

第四個應(yīng)用實例，是對病毒基因組復(fù)制的觀察。標(biāo)題為：利用STED超高分辨顯微鏡觀察復(fù)制的HSV-1病毒【4】。值得一提的是，本文由中科院昆明動物所周巨民老師課題組與徠卡公司合作完成。

病毒基因組復(fù)制是單純皰疹病毒 1 (HSV-1) 溶解感染周期的重要事件。目前由于檢測和觀察方法的局限，病毒復(fù)制過程的細節(jié)仍難以捕捉。為了獲得更加詳細的 HSV-1 復(fù)制機制，本文使用了STED受激發(fā)射損耗顯微鏡，結(jié)合熒光原位雜交 (FISH) 和免疫熒光，對HSV-1 復(fù)制過程進行了精細觀察。
 
作者設(shè)計了位于HSV-1病毒基因組兩端的探針，分別以DIG（綠色）和Biotin（紅色）進行標(biāo)記，在病毒復(fù)制的早期和晚期，分別成像觀察。STED成像發(fā)現(xiàn)，在復(fù)制的早期，紅綠兩色信號的共定位程度較高；而在復(fù)制后期，兩個系數(shù)均發(fā)生了明顯降低，表明HSV-1 基因組在復(fù)制過程中經(jīng)歷了從緊湊到松弛的動態(tài)結(jié)構(gòu)變化，同時需要占用較大的空間進行復(fù)制。
 

05

第五個應(yīng)用實例，是對病毒侵染和傳播過程捕獲的研究。標(biāo)題為：ARP2和病毒誘導(dǎo)的絲狀偽足促進了人類呼吸道合胞體病毒的傳播【5】。

利用STED超高分辨顯微鏡進行成像，發(fā)現(xiàn)感染了RSV病毒的細胞（圖A首行，標(biāo)記為A和C）外存在大量的絲狀偽足（紅色），且富集有大量病毒顆粒（綠色）；暗示可通過絲狀偽足將RSV病毒傳遞給鄰近細胞。而在ARP2敲除的細胞中（圖A第二行），即便感染了RSV病毒，細胞的絲狀偽足數(shù)量都大量減少，病毒在細胞間的傳播不明顯。放大圖像（圖B），可觀察到RSV病毒主要分布在絲狀偽足的*，進一步驗證了病毒可通過誘導(dǎo)絲狀偽足的產(chǎn)生來促進其在細胞間的傳播。
 

如何進一步提高STED分辨率？

根據(jù)公式我們可以知道，通過增加STED激光功率就可直接增加圖像的分辨率，這個方法簡單；但問題是不利于活細胞成像。那么如何在不提高激光功率的前提下，進一步提高STED分辨率呢？有以下三種方法，分別是gated STED，gated STED + Lightning，和徠卡新推出的τ-STED。
 

01

以兩個距離76nm的DNA Origami為例，gated STED在不改變STED激光功率的前提下，逐步縮小熒光壽命的檢測范圍，可逐步提高分辨率，清晰地分辨兩個點信號。

02

對中心粒的gated STED + Lightning成像結(jié)果，分辨率（半高寬）可達22nm！

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新一代STED：τ-STED，即將STED和超快速的熒光壽命相結(jié)合，實時呈現(xiàn)超高清分辨圖像。它在已有STED優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，可以更低激光功率獲得更高圖像分辨率，進一步拓展熒光染料的選擇，非常適合長時間的活細胞成像。

結(jié)語
徠卡STED擁有13年的研發(fā)、技術(shù)和服務(wù)經(jīng)驗，也具有以下突出優(yōu)勢特點，是病毒學(xué)研究的*利器：

• “純光學(xué)"超高分辨顯微技術(shù)，所見即所得

• 全光譜、多色超高分辨成像，提供592nm/660nm/775nm三根 STED譜線

• 專為STED設(shè)計的多款滿足不同應(yīng)用需求的物鏡

• 使用常規(guī)熒光染料及熒光蛋白，制樣簡單、方便

• τ-STED低光毒性，更適合活細胞超高分辨成像

• 快速掃描頭能夠更好的保護樣品

• LAS X Navigator能夠輕松尋找目標(biāo)視野

 
此外，整個STED是搭載在徠卡共聚焦平臺上的，因此也擁有共聚焦的所有優(yōu)點。相信徠卡STED超高分辨顯微鏡能夠更多地貢獻超高清圖像結(jié)果，助力病毒學(xué)和生命科學(xué)研究發(fā)展。
 
參考文獻：
【1】Chojnacki J, Staudt T, Glass B, et al. Maturation-dependent HIV-1 surface protein redistribution revealed by fluorescence nanoscopy.[J]. Science, 2012, 338(6106): 524-528.
【2】Hanne J, Gottfert F, Schimer J, et al. Stimulated Emission Depletion Nanoscopy Reveals Time-Course of Human Immunodeficiency Virus Proteolytic Maturation[J]. ACS Nano, 2016, 10(9): 8215-8222.
【3】Wang IH, Suomalainen M, Andriasyan V, et al. Tracking viral genomes in host cells at single-molecule resolution. Cell Host Microbe. 2013;14(4):468–480. 
【4】Li Z, Fang C, Su Y, et al. Visualizing the replicating HSV-1 virus using STED super-resolution microscopy[J]. Virology Journal, 2016, 13(1): 65-65.
【5】Mehedi M, Mccarty T, Martin S E, et al. Actin-Related Protein 2 (ARP2) and Virus-Induced Filopodia Facilitate Human Respiratory Syncytial Virus Spread[J]. PLOS Pathogens, 2016, 12(12).